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miRNA的功能剖析策略

更新時間:2012-05-18      瀏覽次數:2024


 
lin-4,第1個已知的miRNA,在1993年被發覺。自此,miRNA的研討就一發無法收拾。線蟲、蜾蠅等標準樣式有生命的物質的研討鑒定出miRNA的很多重邀功能,涵蓋發育時期細胞增生和失去生命的協調,抗逆性,脂肪代謝等等。相對于這些個劣等的標準樣式有生命的物質,哺乳動物的miRNA功能研討可就復雜得多。

在著手的幾年,科學家們的首重要的條目標是利用克隆、有生命的物質信息學和基因表現等辦法編綴出完整的miRNA目次和它的表現形式。隨著這個目的一天比一天靠近,研討重心又轉移至miRNA功能的解釋。針對這一目的,涌現出多種技術,有報告陳述基因剖析、原位雜交、過表現和沉默、有生命的物質信息學預先推測算法等,他們都有助于miRNA功能的推斷。

剖析miRNA的表現

在鑒定新的miRNA時,一般認為合適而使用三種辦法:正向遺傳基因學、定向克隆和有生命的物質信息學剖析。正向遺傳基因學主要使用于蜾蠅和線蟲中,它經過一個突變表型來理解miRNA的功能。第1個miRNA基因lin-4就是這樣鑒定出的。不過,正向遺傳基因學這樣積年來也就鑒定出非常少幾個miRNA。這是由于miRNA細小,只要突變不影響胚珠序列,他們就有潛在力量耐受,因為這個很難擊中。額外,因為冗余,表型用篩子選不可以辨別眾多miRNA突變體。因為這個正向遺傳基因學沒可能變成鑒定miRNA的主力軍。

在這以后,定向克隆技術的顯露出來,讓多種細胞系和團體中的miRNA大規模鑒定得以成功實現,涵蓋人、小鼠和斑馬魚等。miRNA的克隆流程大概如下所述:在改變性別的聚丙烯酰胺凝膠上離合RNA樣品,并回收體積在18-25 nt的斷片。繼續,給RNA加上5’和3’接頭,并施行RT-PCR,而后將斷片克隆到載體上,構建出cDNA文庫。對單個克隆施行測序和剖析,以確認小RNA。到現在為止測序技術的興盛也大大增進了這種辦法。不過對于某些只在特別細胞類型中表現,或以低水準表現的miRNA來說,鑒定起來仍然有困難程度的。額外,介于物理性質或轉錄后修飾,某些miRNA有可能難于克隆,這也是一個棘手的問題。

同時,科學家們也研發出多種算法,來預先推測miRNA。所得法法都利用了二級結構信息,由于發夾結構的存在是miRNA的主要特點標志。那里面很多辦法還有賴序列的守舊性來區別miRNA候選物和無關的基因組發夾。另一點辦法則評估發夾結構的熱力科學牢穩性,與已知miRNA的序列和結構相仿度。另一種的辦法是考求已知miRNA四周圍的基因組序列,由于很多miRNA都是成簇排布。上下團結小鼠的很多miRNA就是經過這種形式鑒定出的。當然,計算機預先推測出來的候選miRNA還需求實驗的證驗。
 
 
 

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